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当装柱至8 cm时，再在上面加一层0.5cm厚的石英砂。
操作时一直保持上述流速，但要注意不能使砂子顶层露出液面，不能使柱顶变干。
2． 加样
把１mg荧光黄和１mg碱性湖蓝BB溶于１mL 95％乙醇中。
打开色谱柱的活塞，将其顶部多余的溶剂放出。
当液面降至离石英砂顶层时，关闭活塞，将上述溶液用滴管小心地加入柱内。
打开活塞，待液面降至石英砂层时，用滴管取少量95％乙醇洗涤色谱柱内壁上沾有的样品溶液。
3． 洗脱与分离
样品加完并混溶后，开启活塞，当液面下降至石英砂顶层相平时，便可沿管壁慢慢加入95％乙醇进行洗脱，流速控制在每秒钟1～2滴，这时碱性湖蓝BB谱带和荧光黄谱带分离。
碱性湖蓝BB因极性较小，首先向柱下部移动，极性较大的荧光黄留在柱的上端。
通过柱顶的滴液漏斗，继续加入足够量的95％的乙醇，使碱性湖蓝BB的色带全部从柱子里洗下来。
待洗出液呈无色时，更换一只接收器，改用水为洗脱剂，这时荧光黄向柱子下部移动，用容器收集，同样至洗出液呈无色为止，这样分别得到两种染料的溶液。
用旋转蒸发仪浓缩洗脱液得到染料荧光黄与碱性湖蓝BB。
【注释】
[2] 向柱中加样和添加洗脱剂时，应沿柱壁缓缓加入，以免将表层吸附剂和样品冲溅泛起，造成非水平谱带。
洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断，不能使柱顶变干。
因为湿润的柱子变干后，吸附剂可能与柱壁脱开形成裂沟，结果显色不匀，也产生不规则的谱带。
五、思考题
（1） 色谱柱的底部和上部装石英砂的目的何在?
（2） 装柱不均匀或者有气泡、裂缝，对分离效果有何影响?如何避免?
（3） 为什么洗脱的速度不能太快，也不宜太慢?
（4） 为什么荧光黄比碱性湖蓝BB在色谱柱上吸附得更加牢固?王爽第三章有机化合物的制备实验第三章有机化合物的制备实验
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